基因工程與Ⅰ型糖尿病：胰島素分泌細胞構建的研究進展

摘要

近年來，Ⅰ型糖尿病的基因治療領域取得諸多進展，包括轉入凋亡相關基因（如FasL）以阻斷免疫排斥反應，以及透過多種基因工程策略，將內分泌細胞系、肝細胞、成纖維細胞等改造為能夠分泌成熟胰島素的細胞，並使其分泌作用接受正常生理調控。本文針對上述研究進展作一綜述。

前言

Ⅰ型糖尿病由胰島β細胞遭受自身免疫破壞所致，常規治療為定期注射胰島素。然而，外源性補充難以使血糖達到功能良好的β細胞自然分泌胰島素時的控制狀態，急性併發症（低血糖與酮症酸中毒）偶爾發生，慢性併發症更是威脅糖尿病患者的主要危險[1]。

為建立內源性胰島素分泌系統，學界曾嘗試胰腺移植或胰腎聯合移植，但需長期免疫抑制治療，且失敗率較高；從異體分離β細胞進行移植亦存在諸多缺陷，加之胰腺供體有限。目前的替代策略主要有二：一是利用異種胰島或β細胞系；二是對非β細胞進行基因改造，後者須具備下列特性：

• ①表達GK（葡萄糖激酶）與GLUT2；
• ②低表達高親和力的己糖激酶（HK）；
• ③表達激素原轉換酶PC2、PC3，能有效將胰島素原加工為胰島素；
• ④具備可將胰島素釋放至細胞外的分泌系統。

然而，唯有天然β細胞同時具備上述所有特性，因此研究者轉而探索對其他細胞進行改造。

一、細胞的基因工程構建

1.1 異種胰島細胞

胎豬胰島移植用於治療Ⅰ型糖尿病具有較好的療效且取材便利，但因免疫排斥顯著，療效難以持久[2]。FasL受體表達於免疫細胞表面，FasL與Fas受體相互作用可誘導免疫細胞凋亡，故該機制在維持免疫系統穩態及免疫耐受中發揮重要作用。Lau等的研究顯示，同時移植經基因工程處理、能表達Fas配體（FasL）的肌纖維細胞，可明顯延長移植胰島細胞的存活期；但半數以上的小鼠移植物仍在80天內失效，部分原因在於肌纖維細胞停止表達FasL[3]，如何實現FasL的長期表達尚待進一步研究。

1.2 β細胞株構建

β細胞類細胞系是一類較符合生理的胰島替代物，經構建的細胞株可大量獲得。在轉基因小鼠胰島細胞中定向表達SV40大T抗原可誘發胰島素瘤，已成為細胞株的重要來源[4]。此類細胞對葡萄糖刺激的胰島素反應存在缺陷，表現為反應減弱或過強，可能與葡萄糖感應器——葡萄糖激酶（GK）及葡萄糖轉運體（GLUT2）——的表達異常有關[5]。此外，未經免疫隔離的細胞將被免疫系統殺滅，故這種永生型細胞移植於人體時需作微包囊化處理。

1.3 神經內分泌細胞

早在1983年，即有學者對神經內分泌細胞株（一種分泌ACTH的細胞株AtT20）進行生物改造，利用病毒啟動子調控人胰島素cDNA轉錄，獲得初步結果。在胰腺特異性啟動子的調控下，GK基因可在AtT20細胞中表達，以表達載體轉染後即表現出葡萄糖刺激的胰島素釋放[6]。正常的葡萄糖感應不僅需要表達GLUT2，還需具備近似正常β細胞的GK/HK活性比值[7]。最近有學者將胰島素原表達載體直接導入NOD小鼠的垂體間葉POMC分泌細胞，可大量分泌成熟胰島素，且這些細胞不受針對胰島細胞的自身免疫攻擊。將一定量的構建細胞移植於NOD糖尿病小鼠後，高血糖及糖尿病症狀完全恢復；與胰島細胞自體移植相比，其分泌活性更高、再血管化更明顯[8]。

1.4 肝細胞

經基因工程構建的外源型細胞株應用於Ⅰ型糖尿病存在各種障礙，促使許多研究轉向內源性細胞。除胰島細胞外，肝細胞是唯一含有葡萄糖感應器（GLUT2及GK）的體細胞，且許多肝臟特異性基因受生理性葡萄糖濃度調控，因而作為Ⅰ型糖尿病基因治療的靶細胞尤受關注。然而，肝細胞不具備受葡萄糖控制的胞吐分泌顆粒，也無貯存分泌性蛋白的隔離區室，當血糖升高時不會出現早相胰島素分泌；此外，肝細胞缺乏切除C肽所需的激素原轉化酶（PC2與PC3），無法有效加工胰島素原分子[9]。針對上述缺陷，相關研究不斷深入。

Valera等在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）基因調控區的控制下，培育出表達人胰島素原基因的轉基因小鼠。由肝細胞分泌的胰島素原具有生物活性，該動物呈現血糖正常且健康狀況良好；經鏈脲佐菌素（STZ）處理後，其胰島素mRNA水平較STZ處理的非轉基因對照鼠明顯增加，血中C肽上升，血糖水平下降達40%[10]。

此外，肝腫瘤細胞亦可作為胰島素表達載體轉染的候選細胞。Gros等將融合胰島素基因構建於哺乳動物細胞表達載體，其中含有人胰島素原基因（帶有費林蛋白酶切點）及PEPCK基因啟動子片段，再轉染至大鼠肝腫瘤細胞。經Northern印跡、免疫組化及HPLC分析顯示，約90%的胰島素原被加工為胰島素；胰島素分泌反應迅速，經二丙基cAMP加地塞米松誘導15分鐘後分泌量明顯增加，1小時內增加10倍，並伴隨內源性PEPCK基因表達受抑及葡萄糖攝取增加[11]。若同時將人GLUT2基因轉染肝腫瘤細胞，胰島素分泌即可受葡萄糖濃度調控[12]。

1.5 成纖維細胞及其他細胞

Taniguchi以人胰島素原cDNA轉染成纖維細胞（LTK細胞），人胰島素原分泌量達91ng／24小時／10⁶細胞。這些細胞經半透膜（5%瓊脂糖膠）微囊化後，體外研究顯示2×10⁶個微囊化的轉染細胞能穩定產生胰島素原80餘天（204.4±5.2ng/ml／天）；若植入STZ糖尿病小鼠腹腔內，可使血糖恢復正常達30天[13]。另外，將表達胰島素原的質粒轉染成肌細胞，約50%的胰島素原轉化為胰島素，分泌功能持續達1個月[14]。Kuzume則用胰島素原基因構建的腺病毒載體轉染293細胞，再植入胰腺全切的狗體內，與定期注射胰島素組相比，血糖維持正常且生存期明顯延長，即使口服15g葡萄糖後血糖仍保持正常[15]。

二、細胞因子

TGF-β1能下調多種免疫反應。有學者將表達TGF-β1的載體轉染NOD小鼠，使其TGF-β1水平較對照組升高，遲髮型超敏反應受到抑制，從而保護具有自身免疫傾向的NOD小鼠免於發生胰島炎或糖尿病；相反，轉入干擾素γ的NOD小鼠則提早發生糖尿病[16]。此外，血管內皮生長因子（VEGF）與新生血管形成密切相關。觀察顯示，糖尿病NOD小鼠缺血部位的VEGF水平下降，妨礙側枝循環形成；肌肉注射編碼VEGF的腺病毒載體，可使NOD糖尿病小鼠的VEGF水平及新生血管形成恢復正常[17]。

三、表達載體

腺病毒載體較適合體內基因轉導，其特點是產生的滴度高，能有效將基因轉導入靜止期細胞，且遺傳信息保持獨立，可避免插入性突變改變細胞基因型的風險；但其缺點是可激發細胞免疫反應，甚至針對導入的外源基因[18]，且轉入基因的表達時間有限，故不宜用於Ⅰ型糖尿病的長期治療。缺陷型重組逆轉錄病毒載體導入細胞後具有自我更新的特性，可長期表達，但產生的滴度較低，且要求細胞處於增殖期，否則前病毒DNA不易整合到染色體DNA。

目前正在研製的新一代組合載體有望克服上述不足，此類載體由不同病毒的成份與特性組合而成。Woo等用逆轉錄病毒將胰島素原基因導入大鼠肝臟，在病毒末端長末端重複序列的調控下，至少5%～15%的肝細胞被轉染，表達持續達6個月。若單純以STZ處理大鼠，6天後均死於酸中毒；而在轉導2週後再用STZ處理轉基因大鼠，部分大鼠存活長達3週，惟血糖水平仍與對照鼠相近。提示來自肝細胞表達的胰島素原活性可防止肝糖原大量減少、脂肪蓄積及酮體生成，但轉染效率尚不足以使血糖恢復正常[19]。

四、胰島素原加工的改進

生理情況下，胰島素原在β細胞分泌顆粒內需經激素原轉換酶PC2、PC3加工為成熟胰島素。但肝細胞不能有效加工胰島素原，所產物的生物活性較胰島素低。另一種富含於肝細胞的成對鹼性氨基酸蛋白酶（又稱泛轉換酶或費林蛋白酶，furin），僅能識別鼠類胰島素原的Arg-X-Lys-Arg序列，無法有效加工導入的人胰島素原。為此，研究者將furin識別序列引入人胰島素原cDNA的B-C、C-A連接點，再導入肝細胞，即可分泌成熟胰島素[20]。據此，有學者將含furin識別序列的人胰島素原載體轉基因至小鼠肝臟，經高效液相色譜（HPLC）分析顯示，胰島素原能被有效加工為胰島素分子[21]。

五、轉導效率

首先，Page等透過改進培養條件或加入肝細胞生長因子（HGF），可使80%的小鼠肝細胞及40%的人肝細胞被轉導[22]。其次，亦可從改進載體本身著手：一種組合病毒顆粒含有慢病毒（lentivirus，如HIV-1）成份，可將前病毒基因組整合到非分裂期細胞內；若以VSV包膜蛋白作為病毒殼蛋白替代env基因產物製備高滴度逆轉錄病毒載體，即可轉導靜止期肝細胞，極有可能成為Ⅰ型糖尿病基因治療的理想載體。

六、結語

綜上所述，要取代Ⅰ型糖尿病的胰島素注射治療，移植能分泌具有生物活性胰島素的細胞將是未來的主要方向。然而，對細胞進行基因工程改造以建立新型「人工β細胞」的過程相當複雜，要成為成熟的臨床治療手段，尚需進行諸多改進並累積更多臨床驗證；此外，利用細胞因子預防Ⅰ型糖尿病或血管併發症的臨床價值亦有待探索。在這一嶄新領域中，能否催生出可靠的糖尿病治療方法，取決於其療效、安全性、便利性及費用等多重因素。